最近好多朋友在咨询组培污染的原因，其中有一个朋友是在启动培养阶段就出现大比例的污染，我分析了有两个比较大的可能：一个就是外植体没灭菌消毒彻底；另一个就是培养基没灭菌彻底，如灭菌时间不够或冷气未排除干净。
今天我们先说说外植体的灭菌程序。
灭菌前材料先要用自来水冲洗10分钟左右，有的材料较脏，要用洗衣粉等洗涤，把泥土等清洗干净。
有的地下部等组织，带须根多的还要用小刀削光滑，以利于彻底灭菌。
有的材料表面着生较多的绒毛，阻止了消毒剂的附着，影响消毒效果，这是则可在药液中加入湿润剂，如吐温-80（Tween-80）或加入洗衣粉，可大大提高消毒剂的消毒效果。
不同的材料应采取不同的方法和步骤。现在茎段和叶面为例介绍消毒的方法和步骤。
植物的茎和叶多暴露于空气中，其本身又具有较多的绒毛、刺、油脂、蜡质等，故在栽培上易受泥土、肥料等的污染；因此在消毒前要经自来水流水冲洗较长的时间，特别是一些多年生的木本植物更要注意，用蘸有肥皂粉、洗衣粉或洗洁精的软毛刷刷洗；吸干水分后，再用75%乙醇浸泡10-30秒，紧接着用0.5%-10%的次氯酸钠溶液浸泡10-15分钟（应按照材料的老嫩和枝条的坚实程度而定消毒时间）；或用氯化汞浸泡10-12分钟。
如果材料表面不平或有绒毛，可在灭菌溶液中加入几滴吐温-80以增强灭菌效果。材料灭菌后要用无菌水冲洗3-5次，而用升汞处理的则洗5-8次，然后用无菌滤纸擦拭干净或沥干，最后再进行分割接种。
具体灭菌方法和步骤如下：
第一步 清洗外植体
切取材料的幼茎或尚未完全展开的叶片，浸入稀释的肥皂液中浸泡，再用软刷轻轻刷洗外植体的表面，清除附着在外植体表面的尘土和部分菌体，然后用自来水冲洗，出去肥皂液和污物。这样处理可除去外植体表面90%的微生物。
第二步 75%乙醇灭菌
酒精浓度应该视外植体表面的干湿而定，表面湿润的外植体可以将浓度提高到80%；乙醇的用量一般为外植体体积的10倍以上；灭菌时间应严格控制在10-30秒。
第三步，0.1%氯化汞灭菌
灭菌时间的长短依照材料的带菌情况而定，通常在5-15分钟。灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触。若在氯化汞中加入几滴吐温-80，可以降低表面张力，提高杀菌效力。
第四步 无菌水漂洗
经过灭菌的外植体，要用无菌水冲洗；如果用氯化汞灭菌的，必须彻底除去残留的汞离子，否则外植体会受到明显的伤害。
除去汞离子的常用方法是用无菌水漂洗5次以上，每次无菌水用量以淹没外植体为宜，并不断摇动。经过这样的处理，基本可以消除残留的汞离子的伤害。
经此灭菌程序，染菌率可以控制在10%以内，有时可达5%以下。此杀菌程序具有一定的通用性。
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